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Oct 14, 2023

Les niveaux actuels de pollution microplastique ont un impact sur les microbiomes intestinaux des oiseaux de mer sauvages

Écologie de la nature et évolution

Nature Ecology & Evolution volume 7, pages 698–706 (2023)Citer cet article

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Les microplastiques contaminent les environnements du monde entier et sont ingérés par de nombreuses espèces, dont la santé est affectée de multiples façons. Une dimension clé de la santé qui peut être affectée est le microbiote intestinal, mais ces effets sont relativement inexplorés. Ici, nous avons étudié si les microplastiques sont associés à des changements dans les microbiomes proventriculaires et cloacaux chez deux espèces d'oiseaux de mer qui ingèrent de manière chronique des microplastiques : les fulmars boréaux et les puffins cendrés. La quantité de microplastiques dans l'intestin était significativement corrélée à la diversité et à la composition microbienne de l'intestin : les microplastiques étaient associés à une diminution du microbiote commensal et à une augmentation des agents pathogènes (zoonotiques) et des microbes résistants aux antibiotiques et dégradant le plastique. Ces résultats illustrent que les concentrations et les mélanges de microplastiques pertinents pour l'environnement sont associés à des changements dans les microbiomes intestinaux chez les oiseaux de mer sauvages.

Les microplastiques représentent une menace émergente pour la faune et la santé humaine1,2. Ces petites particules de plastique (<5 mm) contaminent les plans d'eau, les sols et l'air1,3. L'omniprésence des microplastiques a favorisé de vastes recherches visant à déterminer les effets négatifs potentiels sur la santé des animaux exposés, y compris les humains1,3. La recherche a démontré que les microplastiques peuvent avoir des effets délétères sur les animaux et leur santé3. Malgré ces travaux, notre compréhension des effets de l'ingestion de microplastiques sur les communautés du microbiome intestinal est faible.

Le microbiome est la collection de microbes dans une zone donnée du corps qui a formé une relation symbiotique évolutive avec son espèce hôte4. Ainsi, les microbiomes sont essentiels pour héberger la nutrition, la physiologie, la fonction immunitaire, le développement et même le comportement, et de nombreuses maladies ont été associées à des microbiomes intestinaux altérés5. Les microbiomes peuvent changer dans la diversité taxonomique et fonctionnelle chez les animaux soumis à des facteurs de stress anthropiques tels que la pollution environnementale6,7. Dans cette optique, des études en laboratoire ont révélé que les microplastiques peuvent provoquer des changements dans les microbiomes intestinaux avec des implications négatives pour la santé8,9,10. En tant que domaine à ses débuts, cependant, les effets des microplastiques sur les populations sauvages sont encore inconnus. Considérant que les niveaux de pollution microplastique devraient augmenter et s'accumuler avec le temps11, il est impératif de comprendre comment la santé de la faune, reflétée par le microbiome intestinal, est affectée.

Dans cet article, nous avons étudié la réponse microbienne intestinale à divers degrés d'ingestion de microplastiques, quantifiée par le comptage et la pesée des microplastiques, chez deux espèces d'oiseaux marins différentes : le puffin cendré (Calonectris borealis), n = 58 individus, collecté sur l'archipel des Açores au Portugal et le fulmar boréal (Fulmarus glacialis), n = 27 individus, collecté dans la baie de Baffin, au Canada. Leurs distributions couvrent les deux hémisphères (Extended Data Fig. 1). Les deux espèces ingèrent des débris plastiques, et en particulier le fulmar est établi comme un bioindicateur des plastiques12,13,14,15. En étendant l'attention du seul microbiome intestinal (qui chez les oiseaux est généralement déterminé par l'échantillonnage du cloaque) pour inclure également le microbiome du proventricule, nous avons également cherché à déterminer si l'ingestion de microplastiques a des conséquences similaires sur les microbiomes du tractus gastro-intestinal (GIT) à mesure qu'il progresse le long du tube digestif. En utilisant le séquençage du gène de l'ARN ribosomal 16S, nous avons constaté que les phylums les plus abondants dans l'ensemble de données étaient les protéobactéries (49,9%), les Firmicutes (33,1%), les Actinobacteriota (6,2%), les Fusobacteriota (4,2%) et les Bacteroidota (3,7%; Extended Data Fig. 2), qui représentaient plus de 97% des 4 602 578 lectures.

En utilisant des modèles mixtes linéaires et en tenant compte d'autres variables biologiques et expérimentales (résultats supplémentaires), nous avons testé si la diversité alpha microbienne (nombre observé de variants de séquence d'amplicon (ASV), indice de Shannon, diversité phylogénétique de Faith (PD) et métrique H d'Allen) des microbiomes proventriculaires et cloacaux chez les deux espèces était associée aux microplastiques (nombre et masse ; résultats supplémentaires) et, en incluant des termes d'interaction, si les effets des microplastiques étaient similaires entre les espèces d'oiseaux marins et dans l'ensemble de la GIT. Pour toutes les métriques de diversité alpha, le nombre de microplastiques était significativement corrélé positivement avec la diversité alpha microbienne dans le proventricule (nombre observé d'ASV : β = 0,67, t81 = 2,96, P = 0,004 ; indice de Shannon : β = 0,27, t81 = 2,85, P = 0,006 ; PD de Faith : β = 1,68, t8 1 = 3,46, P < 0,001 ; métrique H d'Allen : β = 0,07, t81 = 2,73, P = 0,007 ; Fig. 1, Données étendues Fig. 3 et Tableau supplémentaire 1). Ces associations étaient significativement plus importantes dans le proventricule que dans le cloaque (nombre d'ASV observé : P = 0,011 ; PD de Faith : P = 0,001 ; avec une tendance pour l'indice de Shannon : P = 0,084 et la métrique H d'Allen : P = 0,089), où cet effet était proche de zéro (nombre d'ASV observé : β = 0,01 ; indice de Shannon : β = 0,08 ; PD de Faith : β = −0,06 ; métrique H d'Allen : β = 0,02).

a–f, chaque point représente un échantillon de microbiome qui est coloré par l'emplacement dans le GIT, soit du microbiome proventriculaire (points bleus, n = 85) soit du microbiome cloacal (points orange, n = 84). Mesures de diversité alpha : nombre observé d'ASV (notez que l'échelle est non linéaire en raison de la transformation de la racine carrée des valeurs de diversité alpha) (a et b), l'indice de Shannon (c et d) et la PD de Faith (e et f) sont tracés par rapport à la proportion de comptages de MP (nombre de MP/masse d'oiseau individuelle ; à gauche) et à la proportion de masse de MP (masse de MP/masse d'oiseau individuelle ; à droite). Les lignes de chaque graphique indiquent les valeurs prédites basées sur le modèle mixte linéaire pour cette métrique de diversité alpha, et les zones ombrées flanquant les lignes indiquent les intervalles de confiance supérieur et inférieur à 95 %.

En ce qui concerne la masse de microplastiques, les oiseaux avec une plus grande masse de microplastiques avaient un indice de Shannon significativement plus faible (β = -0,20, t81 = -2,38, P = 0,020), la PD de Faith (β = -1,12, t81 = -2,47, P = 0,016) et la métrique H d'Allen (β = -0,06, t81 = -2,54, P = 0,013 ) et une corrélation négative tendancielle avec le nombre observé d'ASV (β = −0,40, t81 = −1,95, P = 0,055) dans le microbiome proventriculaire (Fig. 1 et Tableau supplémentaire 1). Ces associations différaient significativement entre le microbiome proventriculaire et cloacal lors de l'examen de la PD de Faith (P = 0,006) et de la métrique H d'Allen (P = 0,020), et montraient une tendance pour le nombre observé d'ASV (P = 0,073) et l'indice de Shannon (P = 0,090). Dans le cloaque, l'association avec la PD de Faith cloacale était - contrairement au proventricule - positive (β = 0,36), alors qu'elle était proche de zéro pour le nombre observé d'ASV (β = 0,05), l'indice de Shannon (β = −0,02) et la métrique H d'Allen (β = 0,01). La suppression d'échantillons pouvant être considérés comme des valeurs aberrantes (inférieures au premier centile ou supérieures au 99e centile) n'a pas considérablement modifié les résultats (tableau supplémentaire 2). De même, les modèles utilisant le nombre ou la masse de microplastiques sans standardisation par masse d'oiseau n'ont pas non plus modifié substantiellement les résultats (tableau supplémentaire 3).

En général, le nombre et la masse des microplastiques étaient significativement corrélés (respectivement positivement et négativement) à la diversité alpha, avec des corrélations plus importantes en avant (proventricule) qu'en arrière (cloaque), ce qui suggère que les effets des microplastiques sur la diversité alpha microbienne diminuent à mesure qu'ils traversent le GIT. Si les microplastiques agissent comme vecteurs de microbes pathogènes et/ou étrangers2,16, alors ce mode d'action pourrait diminuer le long du GIT à mesure que les microbes faisant de l'auto-stop entrent en contact et entrent en compétition avec davantage de microbes résidents et doivent survivre à l'empilement des défenses immunitaires de l'hôte17. De plus, bien que le rôle des microplastiques en tant que vecteurs de produits chimiques organiques hydrophobes reste incertain18, des études récentes ont montré que leur désorption dans les microplastiques diminue de façon exponentielle avec le temps dans les solutions d'intestins artificiels19 et est plus élevée à des températures plus élevées et à un pH plus bas (réf. 20), qui - au moins chez les poulets - est le plus bas dans le proventricule21.

L'observation selon laquelle la PD de Faith expliquait la plus grande variation (résultats supplémentaires) et était la plus affectée par les microplastiques étayait davantage la conclusion selon laquelle les microplastiques pouvaient agir comme vecteurs microbiens. Cela suggère que les microplastiques peuvent introduire non seulement une plus grande quantité de microbes dans les microbiomes GIT (reflétés par une richesse qui a également augmenté), mais également une plus grande diversité de microbes de différentes lignées évolutives. Notamment, la façon dont la quantité de microplastiques a été mesurée a révélé différents impacts potentiels des microplastiques sur le microbiome GIT. Alors que le nombre de microplastiques était généralement associé positivement à la diversité alpha, la masse microplastique était généralement associée négativement. Bien que le nombre de microplastiques puisse augmenter la diversité alpha en agissant comme des vecteurs2,16, la masse microplastique tient compte du volume et de la densité, cette dernière pouvant être influencée par le type et les propriétés du polymère22. Ainsi, la masse reflète probablement plus les différences de propriétés des polymères que le nombre. Étant donné que des additifs antimicrobiens peuvent être ajoutés aux polymères plastiques22, une augmentation de la masse d'un tel polymère pourrait diminuer la diversité alpha microbienne. L'analyse de ces différences nécessiterait plus de connaissances sur les types de polymères microplastiques et leurs additifs, et apparaît comme une voie fertile pour les recherches futures.

La sélection du modèle n'a pas pris en charge l'interaction entre les microplastiques (nombre et masse) et les espèces d'oiseaux de mer hôtes (méthodes) ; ainsi, toutes les corrélations entre les microplastiques et la diversité alpha microbienne de l'intestin étaient similaires entre les fulmars boréaux et les puffins cendrés. Cela suggère que les effets observés dans cette étude peuvent s'appliquer largement aux Procellariiformes qui ingèrent des microplastiques.

Ensuite, nous avons étudié si les microplastiques étaient corrélés à la composition microbienne du GIT entre les individus (diversité bêta) et si ces corrélations étaient similaires entre les espèces d'oiseaux de mer et dans tout le GIT. Pour ce faire, nous avons utilisé des tests de permutation mis en œuvre dans vegan::adonis avec 9 999 permutations (résultats supplémentaires)23. À des fins de visualisation, les résultats des microplastiques ont été tracés dans des tracés d'analyse des coordonnées principales (PCoA) (données étendues, figures 4 à 8), qui ne peuvent représenter que deux dimensions à la fois, alors que ces résultats statistiques ont été évalués dans toutes les dimensions des matrices de diversité bêta. Lors de l'examen du nombre de microplastiques, nous avons constaté que le nombre était significativement corrélé à la diversité bêta lors de l'utilisation de distances UniFrac pondérées (P <0,001) et non pondérées (P <0,001), ainsi que des distances euclidiennes dans l'approche du rapport logarithmique d'Aitchison pour les données de composition (P <0,001; Données étendues Fig. 4 et tableau supplémentaire 4). Cependant, cela dépendait non seulement de l'emplacement du microbiome dans le GIT (UniFrac pondéré : P = 0,008 ; UniFrac non pondéré : P < 0,001 ; Aitchison : p = 0,001 ; Extended Data Fig. 5), mais aussi des espèces d'oiseaux de mer hôtes (UniFrac pondéré p = 0,043 ; UniFrac non pondéré : p < 0,001 ; Aitchison : P < 0,0 01 ; données étendues Fig. 6 et tableau supplémentaire 4). Cela signifie que le nombre de microplastiques a différentes associations avec la diversité bêta dans le proventricule par rapport au cloaque, et entre les espèces.

En passant du nombre de microplastiques à la masse, nous avons constaté que la masse était significativement corrélée à la diversité bêta lors de l'utilisation de distances UniFrac non pondérées (P <0,001) et de l'approche d'Aitchison (P <0,001) et une tendance lors de l'utilisation de distances UniFrac pondérées (P = 0,069; Données étendues Fig. 4). Cela dépendait de l'emplacement du microbiome dans le GIT lors de la prise en compte des distances UniFrac pondérées (P = 0,016; Données étendues Fig. 7a, b) et de l'approche d'Aitchison (P = 0,011; Données étendues Fig. 7e, f), ainsi que de l'espèce hôte étudiée (UniFrac pondéré : P <0,001 ; UniFrac non pondéré : P <0,001 ; Aitchison : P <0,0 01 ; données étendues Fig. 8 et tableau supplémentaire 4). Par conséquent, la masse microplastique était associée à la composition microbienne du proventricule et du cloaque différemment uniquement lorsque l'on considère les distances UniFrac pondérées et l'approche d'Aitchison, mais pas les distances UniFrac non pondérées. De plus, cette association dépendait de l'espèce hôte considérée. Les résultats des modèles utilisant le nombre ou la masse de microplastiques sans standardisation par masse d'oiseau ont montré des résultats similaires (tableau supplémentaire 5). Étant donné que les espèces hôtes que nous avons étudiées ont été collectées dans des endroits éloignés, appartiennent à différents genres et représentaient différents groupes d'âge (adultes par rapport aux jeunes à l'envol), il n'était pas surprenant que leurs compositions de microbiome GIT diffèrent24, ce qui signifie que les taxons microbiens disponibles pour être déplacés pourraient ne pas être les mêmes. De futures études seront nécessaires pour démêler les rôles de la phylogénie de l'hôte, de l'âge et de l'emplacement géographique dans la modulation des effets des microplastiques sur les microbiomes intestinaux de la faune.

Pour comprendre quels taxons pourraient être à l'origine des associations entre les microplastiques et la diversité bêta microbienne, nous avons effectué un test ANCOM25, qui a déterminé que 17 ASV étaient différemment abondants (Fig. 2 et résultats supplémentaires). Parmi ceux-ci, dix étaient associés à un nombre de microplastiques (Fig. 2a) et cinq étaient associés à une masse microplastique (Fig. 2b). Les genres Catellicoccus, Cetobacterium et Pseudoalteromonas étaient associés à la fois au nombre et à la masse de microplastiques. Notamment, à mesure que le nombre de microplastiques augmentait, l'abondance du microbiote résident associé à des hôtes sains diminuait, tandis que l'abondance de microbes connus pour être impliqués dans la maladie, la résistance aux antibiotiques et la dégradation du plastique et ceux considérés comme des agents pathogènes zoonotiques augmentait. Par exemple, Pseudoalteromonas, qui comprend des bactéries marines généralement associées à des organismes sains26, était négativement associée au nombre de microplastiques, tout comme les membres connus du microbiote des oiseaux (marins), tels que Psychrobacter26,27, Enterococcus28,29, Catellicoccus30,31 et Staphylococcus32,33. En revanche, Corynebacterium xerosis était positivement associé au nombre de microplastiques et a été identifié comme un agent pathogène émergent susceptible de devenir zoonotique34,35, son genre ayant montré des capacités de dégradation du plastique (base de données dans la réf. 36). De plus, bien que Lactobacillus aviarius soit un membre commun du microbiote aviaire37, une abondance accrue est révélatrice d'un développement médiocre chez les oiseaux29. En corrélation positive avec le nombre de microplastiques, Parvimonas, un prédicteur du cancer colorectal chez l'homme38, et Cetobacterium, qui est résistant à l'antibiotique vancomycine39. Clostridium perfringens, qui présentait la plus grande association positive avec la masse microplastique et une plus grande association avec le microbiome cloacal par rapport au microbiome proventriculaire, est un agent pathogène chez les poulets qui produit des toxines extracellulaires pouvant provoquer une entérite nécrotique aviaire ainsi qu'une gangrène gazeuse potentiellement mortelle et une intoxication alimentaire chez l'homme40. Les autres agents pathogènes potentiels associés à la masse microplastique étaient Fusobacterium41 et Edwardsiella42,43.

a–e, chaque point représente un ASV tracé par son affectation taxonomique sur l'axe y et dans l'ordre décroissant de son coefficient de rapport logarithmique centré (clr) sur l'axe x. Ainsi, les points à droite du centre zéro montrent une corrélation positive avec les microplastiques, tandis que les points à gauche montrent une corrélation négative. Les ASV tracés ont été identifiés comme différentiellement abondants par l'ANCOM (à w0 = 0,70) selon le nombre de microplastiques (a), la masse de microplastiques (b), l'interaction entre le nombre de microplastiques et le type d'échantillon (les points bleus représentent le proventricule, les points rouges représentent le cloaque) (c), l'interaction entre la masse de microplastique et le type d'échantillon (les points bleus représentent le proventricule, les points orange représentent le cloaque) (d) et l'interaction entre le nombre de microplastiques et les espèces (les points verts représentent Cor y's puffins, les points violets représentent les fulmars boréaux) (e). L'ANCOM a identifié 17 ASV à abondance différentielle ; cependant, 21 points sont affichés ici parce que 3 des 17 ASV sont associés au nombre de microplastiques (a) ainsi qu'à la masse microplastique (b ; annoté comme Catellicoccus sp., Cetobacterium sp. et Pseudoalteromonas sp.) et un ASV est associé à la fois à la masse microplastique (b) et à l'interaction entre le nombre de microplastiques et le type d'échantillon (c ; annoté comme Edwardsiella sp.).

Les genres Cetobacterium et Fusobacterium ont également été associés à l'ingestion de plastique chez des tortues caouannes en captivité (Caretta caretta) sauvées du nord-ouest de la mer Adriatique44. Cela suggère que les microplastiques peuvent avoir des impacts similaires sur les communautés microbiennes intestinales, non seulement entre des espèces étroitement apparentées telles que les oiseaux de mer dans notre étude, mais également entre des espèces plus éloignées qui habitent des environnements similaires.

Sur les 17 ASV différentiellement abondants au total, 3 étaient négativement associés à l'interaction entre le nombre de microplastiques et la localisation GIT (Fig. 2c; Flaviflexus, Edwardsiella et Corynebacterium). Deux ASV étaient associés à l'interaction entre la masse microplastique et la localisation GIT : Clostridium perfringens, qui était positivement corrélé, et Acinetobacter, qui était négativement corrélé (Fig. 2d). Pour les deux ASV, l'ampleur de la corrélation était plus élevée dans le microbiome cloacal que dans le microbiome proventriculaire. L'ANCOM a révélé qu'un ASV appartenant au genre Catellicoccus était négativement associé à l'interaction entre le nombre de microplastiques et les espèces d'oiseaux de mer hôtes, mais aucun ASV n'était associé à l'interaction entre la masse microplastique et les espèces hôtes (Fig. 2e).

Nous avons exploré si les effets des microplastiques étaient liés à la condition corporelle de l'hôte en utilisant l'indice de masse à l'échelle calculé en utilisant la longueur du tarse et la masse corporelle individuelles. Cependant, les seuls prédicteurs significatifs de l'état corporel étaient les espèces hôtes (β = −0,76, t = -3,98, p =< 0,001) et l'interaction entre les espèces et le nombre de microplastiques (β = −0,94, t = −3,62, P ≤ 0,001), mais pas le nombre de microplastiques seul (tableau supplémentaire 6). Ainsi, tous les effets que les microplastiques peuvent avoir sur la santé de l'hôte n'ont pas été pris en compte par notre mesure de l'état corporel. De plus, l'état corporel n'était un prédicteur significatif dans aucun modèle de diversité alpha (tableau supplémentaire 7). Dans nos modèles de diversité bêta, l'état corporel a prédit de manière significative les distances UniFrac non pondérées (P = 0,007) et Aitchison (P <0,001; Tableau supplémentaire 8). Par conséquent, bien que les microplastiques soient liés à des aspects de la composition microbienne, le mécanisme par lequel les microplastiques pourraient provoquer des changements microbiens ne semble pas être lié à l'état corporel.

Pour résumer, nous avons constaté que les microplastiques ingérés étaient corrélés à la diversité et à la composition microbiennes dans les GIT des oiseaux marins. Les associations entre les microplastiques et la diversité alpha ne dépendaient pas des espèces d'oiseaux de mer hôtes, alors que leurs corrélations avec la diversité bêta étaient spécifiques à l'espèce hôte. Les microplastiques étaient plus fortement corrélés avec les microbiomes proventriculaires par rapport aux microbiomes cloacaux. De plus, une augmentation des microplastiques était associée à une diminution du microbiote commensal et à une augmentation des agents pathogènes (zoonotiques) et des microbes résistants aux antibiotiques et dégradant le plastique. Bien que nous notions que ces résultats ont été obtenus à partir du séquençage du gène de l'ARNr 16S, qui présente des limites en termes d'identification taxonomique au niveau de la souche et d'identification des fonctions microbiennes, notre étude confirme les prédictions précédentes selon lesquelles l'ingestion chronique de microplastiques est associée à la dysbiose intestinale2.

Notre étude montre que les concentrations et les mélanges de microplastiques pertinents pour l'environnement sont en corrélation avec la diversité microbienne intestinale, soulignant le potentiel de dysbiose intestinale chez les oiseaux de mer sauvages vivant à distance avec des voies de migration à grande échelle et connus pour ingérer des débris de microplastiques dans la nature12,13,14. Les fulmars boréaux sont des bioindicateurs bien connus de la pollution microplastique45. Nos résultats fournissent la base sur laquelle les recherches futures peuvent examiner les impacts négatifs cumulatifs des microplastiques dus à une exposition chronique, en particulier si l'on considère que les microplastiques peuvent être conservés pendant des semaines ou des mois chez les Procellariiformes et donc peu susceptibles de dépendre entièrement du dernier repas46. Les implications sont considérables : d'une part, les humains sont également exposés aux micro- (et nano-) plastiques47,48,49, ce qui soulève la question de savoir comment les humains et leur santé (intestinale) pourraient être affectés par l'ingestion de plastique. D'autre part, le microbiome intestinal joue un rôle central dans la santé de l'hôte, et à mesure que les zoonoses et l'état de santé de la faune dans un monde globalisé attirent de plus en plus l'attention50, la recherche des causes et des origines d'éventuelles zoonoses futures gagne en importance.

Cette étude a été menée dans le cadre de deux projets en cours qui surveillent respectivement les puffins cendrés (C. borealis) au bord du gyre subtropical de l'Atlantique Nord sur l'archipel des Açores (Portugal) et les fulmars boréaux (F. glacialis) près de Qikiqtarjuaq, Nunavut dans l'Atlantique Nord-Ouest (Extended Data Fig. 1; BirdLife International51). Les deux espèces appartiennent à la famille des Procellariidae, se nourrissent en surface et ingèrent des débris microplastiques12,13,14,52,53. Des collectes de fulmars boréaux ont été effectuées pendant la saison de reproduction entre juillet et août 2018. Au total, 27 adultes de fulmars boréaux ont été abattus loin des sites de reproduction13. Des collectes de puffins cendrés ont été effectuées pendant la saison de décollage, lorsque les oisillons sont connus pour entrer en collision avec des bâtiments et d'autres structures artificielles lors de l'abandon du nid, souvent en raison de leur sensibilité à la pollution lumineuse nocturne artificielle, qui peut entraîner la mort. Des cadavres de jeunes naissants frais ont ensuite été collectés près des colonies des Açores entre octobre et novembre 2017 et 2018. Les oiseaux ont été congelés à -20 ° C jusqu'au moment de la dissection et de l'échantillonnage du microbiome, ce qui a conduit à un total de 58 jeunes individus collectés.

Les oiseaux de mer collectés ont été disséqués et échantillonnés dans des conditions stériles selon un protocole standardisé15,54. En plus de ce protocole, des écouvillons stériles ont été utilisés pour échantillonner le proventricule et le cloaque de chaque oiseau individuel (à l'exception d'un individu de fulmar boréal, qui a été échantillonné par erreur une seule fois au proventricule). Chaque écouvillon a été placé dans un tampon de conservation des acides nucléiques55 et conservé à -20 °C jusqu'à l'extraction de l'ADN. Les débris de plastique collectés à partir du GIT sur un tamis de 1 mm ont été collectés, examinés au microscope optique et caractérisés selon les protocoles décrits dans la réf. 56. Par souci de concision, nous appelons ces débris plastiques des microplastiques, même si tous les morceaux mesurés n'étaient pas inférieurs à 5 mm (Rodríguez et al., en préparation)13. Ainsi, pour chacun des 85 individus d'oiseaux marins, nous avons collecté des données sur la masse corporelle et la longueur du tarse de l'individu, le nombre et la masse totale de microplastiques dans son GIT (à l'aide d'une balance avec une précision de ± 0,0001 g), et son microbiome proventriculaire (n = 85) et cloacal (n = 84).

L'ADN des écouvillons entiers a été extrait à l'aide du kit d'extraction NucleoSpin « ADN du sol » de Macherey-Nagel (Allemagne) en suivant le protocole du fabricant. Une étape supplémentaire de battement de billes a été incorporée dans le protocole pour lyser mécaniquement les cellules bactériennes6. Tout au long de cette étape, 16 blancs d'extraction contenant uniquement les réactifs d'extraction ont été inclus puis séquencés pour pouvoir identifier et éliminer une éventuelle contamination.

Suite à l'extraction de l'ADN, nous avons ciblé la région hypervariable V4 du gène de l'ARNr 16S à l'aide des amorces bactériennes 515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′) et 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) (réf. 57), auxquelles nous avons ajouté des adaptateurs d'amorce sens (CS1-515F) et d'amorce inverse (CS2-806 R) pour pouvoir utiliser la chimie de séquençage Fluidigm (Access Array System for Illumina Sequencing Systems, Fluidigm Corporation). Nous avons amplifié cette région cible en deux étapes de la chaîne de réaction de la polymérase (PCR en deux étapes ; informations supplémentaires), en veillant à inclure des blancs de PCR comprenant uniquement les réactifs de PCR tout au long de ce processus. Dans la première étape, un volume total de PCR de 10 µl composé de 1 µl d'ADN extrait (5 à 10 ng), 1,5 µl (200 nM) d'amorces directes et inverses regroupées, 5 µl AmpliTaq Gold 360 Master Mix et 2,5 µl de dH2O ultrapure a été exécuté dans les conditions de PCR suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 10 min ; 40 cycles comprenant une dénaturation à 95 °C pendant 30 s, un recuit à 60 °C pendant 30 s et une élongation à 72 °C pendant 45 s ; allongement final à 72 °C pendant 7 min. Une électrophorèse sur gel pour chaque échantillon a été réalisée pour assurer le succès de la PCR. La deuxième étape de PCR consistait en un volume de PCR de 20 µl qui comprenait 2 µl d'ADN amplifié de la première étape de PCR, 4 µl (400 nM) d'amorces de codes à barres avant et inverse regroupées, 10 µl d'AmpliTaq Gold 360 Master et 4 µl de dH2O ultrapure, qui a été exécuté dans les mêmes conditions de PCR que celles décrites précédemment en dix cycles. Les échantillons à code-barres ont été purifiés par billes (rapport 1: 1), quantifiés et regroupés à 8 nM. Nous avons séquencé par appariement un total de 169 échantillons d'écouvillonnage, 16 blancs d'extraction et 5 blancs de PCR en un seul passage à l'aide de notre propre plate-forme de séquençage interne Illumina MiSeq à l'Institut d'écologie évolutive et de génomique de la conservation, Université d'Ulm, Allemagne.

Les lectures résultant du séquençage des amplicons Illumina MiSeq ont été traitées dans QIIME 2 (version 2020.8.0) à l'aide du plug-in DADA2 pour générer des ASV58,59. La taxonomie a été attribuée avec la fonction classify-sklearn QIIME 2 (et ses paramètres de valeur de confiance par défaut) à l'aide du classificateur SILVA (version 138) formé à l'aide de nos amorces cibles60. Les ASV non attribués aux bactéries au niveau du domaine ainsi que ceux identifiés comme séquences chloroplastiques ou mitochondriales ont été supprimés. Nous avons construit un arbre phylogénétique enraciné comme décrit dans la réf. 6. L'arbre phylogénétique, la taxonomie et les tableaux ASV ainsi que les exemples de métadonnées ont été importés dans R (version 3.6.1) (réf. 61) pour créer un objet phlyoseq à l'aide du package phyloseq (version 1.28.0) (réf. 62) pour des analyses ultérieures.

Dans R, nous avons d'abord exploré les blancs d'extraction et de PCR qui contenaient 185 sur un total de 2 956 ASV. Sur ces 185 ASV, 93 étaient uniques aux blancs et ont ensuite été supprimés. À l'aide du package decontam (version 1.4.0) (réf. 63) avec son identification des contaminants basée sur la prévalence et son seuil par défaut de 0,1, 18 ASV supplémentaires ont été identifiés comme contaminants possibles et supprimés. Nous avons ensuite considéré les échantillons avec une profondeur de séquençage inférieure à 2 900 lectures comme ayant échoué et les avons supprimés, ainsi que tous les ASV qui leur sont propres, de l'ensemble de données. De plus, nous avons appliqué un filtre de prévalence de 2 % et un filtre d'abondance de dix lectures sur l'ensemble de l'ensemble de données pour supprimer les ASV très rares qui sont susceptibles d'être des artefacts de séquençage. Cela a supprimé 254 ASV de l'ensemble de données et supprimé tous les ASV des blancs d'extraction et de PCR. Après filtrage, notre ensemble de données se composait de 4 602 578 lectures sur 2 517 ASV et 169 échantillons, ce qui donne une profondeur de séquençage moyenne de 27 234 ± 5 ​​999 lectures par échantillon.

Pour mieux refléter les effets que les microplastiques peuvent avoir sur chaque individu, nous avons exprimé le nombre et la masse de microplastiques en tant que proportions de la masse de chaque oiseau en divisant le nombre et la masse de microplastiques de chaque individu par sa masse corporelle, bien que nous présentions également les résultats en utilisant uniquement le nombre ou la masse de microplastiques, sans standardisation par masse d'oiseau. Nous avons utilisé ces variables tout au long de l'analyse, mais par souci de brièveté, nous les appelons nombre de microplastiques et masse de microplastiques.

Nous avons d'abord calculé la diversité microbienne intra-individuelle (diversité alpha) à l'aide des métriques et packages suivants : PD de Faith, qui reflète la PD, (package btools, version 0.0.1) (réf. 64) ; l'indice de Shannon (loge), qui tient compte à la fois de la richesse microbienne et de l'homogénéité ; le nombre observé d'ASV, qui reflète la richesse (les deux derniers utilisant tous deux le package phyloseq) ; et la métrique H d'Allen65,66. Ensuite, en utilisant des modèles linéaires à effets mixtes du package nlme (version 3.1.141) (réf. 67), nous avons modélisé chaque métrique de diversité alpha en fonction des éléments suivants : l'interaction entre le nombre de microplastiques (mis à l'échelle) et la localisation GIT (soit proventricule, soit cloaque) ; l'interaction entre la masse microplastique (mise à l'échelle) et l'emplacement GIT ; espèces d'oiseaux de mer hôtes; et la profondeur de séquençage (mise à l'échelle). Nous avons initialement inclus l'interaction entre le nombre de microplastiques (à l'échelle) et les espèces d'oiseaux de mer hôtes, ainsi que l'interaction entre la masse de microplastiques (à l'échelle) et les espèces d'oiseaux de mer hôtes pour tester si les effets des microplastiques sur le microbiome intestinal sont spécifiques à l'espèce hôte. Cependant, non seulement les modèles avec ces deux interactions étaient moins bien ajustés que ceux sans interactions (en utilisant le critère d'information d'Akaike (AIC), ΔAIC> 2), mais aucune des interactions n'était statistiquement significative (P <0, 05), quelle que soit la métrique de diversité alpha. Ainsi, nous avons supprimé ces deux interactions de nos modèles finaux, conservé les seules espèces d'oiseaux hôtes comme facteur explicatif et conclu que tout effet des microplastiques sur la diversité alpha microbienne de l'intestin était similaire entre les fulmars et les puffins, et non spécifique à l'une ou l'autre des espèces. De plus, nous avons pris en compte la non-indépendance due à l'échantillonnage répété du même individu à différents points du GIT (proventricule et cloaque) en définissant l'identification individuelle de l'oiseau comme facteur aléatoire (interception aléatoire). Le meilleur ajustement du modèle a été obtenu en transformant la racine carrée du nombre observé d'ASV et de la métrique H d'Allen68. Les deux mesures de diversité alpha restantes n'ont pas été transformées. Nous avons pris en compte les différentes variances de la diversité alpha entre les échantillons de microbiome proventriculaire et cloacal, ainsi que les différences de variance en fonction de la profondeur de séquençage en ajoutant une structure de variance varComb aux modèles, en suivant le protocole décrit dans la réf. 68. Nous avons vérifié la multicolinéarité entre les variables explicatives à l'aide des facteurs d'inflation de la variance du package automobile (version 3.0.3) (réf. 69), qui n'a révélé aucune variable problématique70. Les valeurs R2 marginales (R2LMM(m)) et conditionnelles (R2LMM(c))71 pour chaque modèle ont été calculées à l'aide du package piecewiseSEM (version 2.1.0) (réf. 72).

Pour analyser la composition de la communauté microbienne GIT chez les deux espèces d'oiseaux de mer, nous avons généré des matrices de distance à l'aide de la fonction phyloseq::distance basée sur des distances UniFrac pondérées et non pondérées, puisque celles-ci ont été développées spécifiquement pour les données sur le microbiome73. De plus, nous avons appliqué l'approche log-ratio d'Aitchison pour les données de composition74, qui consiste à transformer le centre-log de la table ASV après avoir ajouté un pseudo-compte de un et à générer une matrice de distance à l'aide des distances euclidiennes. Nous avons ensuite testé les effets des microplastiques sur la composition microbienne en utilisant des tests d'hypothèse nulle avec le test de permutation implémenté dans la fonction vegan::adonis (version 2.5-5) (réf. 23). Nous avons défini un modèle par matrice de distance (UniFrac pondérée et non pondérée, Aitchison) et utilisé la même formule de modèle que celle décrite dans la section précédente, avec un identifiant d'oiseau individuel défini dans l'argument "strates". Pour visualiser les résultats des données multidimensionnelles, nous avons utilisé des techniques d'ordination sans contrainte PCoA pour les matrices UniFrac pondérées et non pondérées et l'analyse en composantes principales pour l'approche d'Aitchison en utilisant la fonction phyloseq :: ordinate. Pour représenter visuellement les effets de nos variables microplastiques discrètes et continues (nombre et masse), nous les adaptons en tant que vecteurs à nos diagrammes d'ordination à l'aide de la fonction vegan::envfit fonction basée sur les deux premiers axes d'ordination.

Pour déterminer quels taxons microbiens pourraient être à l'origine des différences de diversité bêta associées aux microplastiques, nous avons effectué un test d'analyse de la composition des microbiomes (ANCOM)25. En ajoutant la fonctionnalité de modèle linéaire à effets mixtes du package nlme, nous avons utilisé la même formule de modèle que celle décrite précédemment pour déterminer quels ASV étaient associés au nombre et à la masse de microplastiques, à l'interaction entre les microplastiques et l'emplacement GIT, et à l'interaction entre les microplastiques et les espèces d'oiseaux marins hôtes. Étant donné que l'inflation zéro est une caractéristique des données sur le microbiome qui peut entraîner des taux de fausses découvertes dans ces types d'analyses25, nous avons appliqué un filtre supplémentaire pour ne conserver que les ASV qui étaient présents dans au moins 15 échantillons. Cela a réduit le nombre total d'ASV à 81. Nous avons ensuite exécuté l'ANCOM en utilisant un niveau de signification de 0,05, sélectionné un paramètre de correction modéré pour appliquer la procédure de Benjamini-Hochberg qui corrige les tests multiples25, et utilisé la valeur seuil par défaut w0 = 0,70 de sorte que seuls les ASV pour lesquels l'hypothèse nulle a été rejetée à un taux de 70 % ou plus ont été déterminés comme étant différentiellement abondants. Pour tracer les ASV différentiellement abondants et montrer quels ASV étaient corrélés positivement ou négativement avec les microplastiques, nous avons adapté le code du plug-in QIIME 2 q2-composition59 pour l'analyse des données de composition pour qu'il s'exécute dans R et calculé les estimations des paramètres du modèle à partir du modèle mixte linéaire exécuté sur le rapport de chaque paire ASV dans le tableau ASV transformé en rapport logarithmique centré (clr)25.

Pour explorer les liens entre l'état corporel de l'hôte, l'ingestion de microplastiques et les microbiomes intestinaux de l'hôte, nous avons calculé l'état corporel par oiseau de mer en utilisant l'indice de masse mis à l'échelle avec la longueur individuelle du tarse comme mesure corporelle linéaire75. Ensuite, nous avons utilisé un modèle linéaire généralisé avec une distribution logarithmique gamma et la condition corporelle comme variable de réponse expliquée par le nombre et la masse de microplastiques, ainsi que leurs interactions avec le sexe et les espèces hôtes. Ensuite, nous avons inclus la condition corporelle de l'hôte comme variable explicative dans nos modèles de diversité alpha et bêta décrits ci-dessus.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données de séquençage et les métadonnées correspondantes sont disponibles sur le National Center for Biotechnology Information sous le numéro d'accession PRJNA930758. De plus, les métadonnées sont également stockées sur GitHub (https://github.com/gfackelmann/Current-levels-of-microplastic-pollution-impact-wild-seabird-gut-microbiomes).

Les scripts de notre analyse sont stockés sur GitHub (https://github.com/gfackelmann/Current-levels-of-microplastic-pollution-impact-wild-seabird-gut-microbiomes).

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Les fulmars boréaux ont été prélevés avec des permis de soins aux animaux (Acadia University Animal Care Committee Permit 02-18), des permis fédéraux de travail sur les oiseaux marins et dans les réserves nationales de faune (ECCC NUN-NWA-18-02 et NUN-SCI-18-02) et des permis territoriaux (GN-WL-2018-004, NIRB-17YN069 et NPC-148645). Les puffins cendrés ont été collectés dans le cadre de la Campagne SOS Cagarro organisée par la Direction Régionale des Politiques Marines et la Direction Régionale de l'Environnement et du Changement Climatique du Gouvernement des Açores. Okeanos a reçu des fonds nationaux via la Fondation pour la science et la technologie (FCT) et l'Instituto Público (IP), dans le cadre des projets UIDB/05634/2020 et UIDP/05634/2020 et via le gouvernement régional des Açores (M1.1.A/REEQ.CIENTÍFICO UI&D/2021/010). Nous remercions J. Pereira et S. Blasco pour leur soutien lors de la collecte des échantillons. GF a été financé par la Fondation allemande des bourses universitaires (Studienstiftung des deutschen Volkes), et tous les travaux de laboratoire liés au séquençage du gène de l'ARNr 16S ont été financés par l'Institut d'écologie évolutive et de conservation de l'Université d'Ulm. CKP a été cofinancé par le Programme Opérationnel AÇORES 2020, à travers le Fonds 01-0145-FEDER-000140 'MarAZ Chercheurs : Consolider un corps de chercheurs en Sciences Marines aux Açores' de l'Union Européenne. YR a été financé par une bourse de doctorat du Fonds régional de la science et de la technologie, gouvernement des Açores (M3.1.a/F/022/2020). JEB a été financé par la bourse d'études supérieures du Canada Vanier du CRSNG et une bourse de la famille Weston en recherche nordique. JFP et MLM ont été soutenus par le Programme de lutte contre les contaminants dans le Nord (Relations Couronne-Autochtones et Affaires du Nord Canada).

Financement en libre accès fourni par Universität Ulm.

Institut d'écologie évolutive et de génomique de la conservation, Université d'Ulm, Ulm, Allemagne

Gloria Fackelmann et Simone Sommer

Institut des sciences de la mer - Okeanos, Université des Açores, Horta, Portugal

Christopher K. Pham et Yasmina Rodriguez

Biologie, Université Acadia, Wolfville, Nouvelle-Écosse, Canada

Mark L. Mallory

Division de l'écotoxicologie et de la santé de la faune, Environnement et Changement climatique Canada, Ottawa, Ontario, Canada

Jennifer F. Provencher

Département des sciences des ressources naturelles, Université McGill, Sainte-Anne-de-Bellevue, Québec, Canada

Julia E. Baak

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GF a conceptualisé et conçu l'étude, effectué les travaux de laboratoire, analysé les données et rédigé le manuscrit sous la supervision du SSCKP a obtenu un financement et des permis pour échantillonner C. borealis. YR a recueilli les données associées à C. borealis. MLM et JFP ont obtenu un financement et des permis pour échantillonner F. glacialis. MLM, JFP et JEB ont collecté les données associées à F. glacialis. SS a obtenu un financement pour toutes les analyses de laboratoire liées au microbiome dans le cadre de son programme de santé de la faune soutenu par l'Université d'Ulm. Tous les auteurs ont révisé et édité le manuscrit.

Correspondance à Gloria Fackelmann ou Simone Sommer.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Ecology & Evolution remercie Lauren Roman, Antton Alberdi et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Des puffins cendrés ont été prélevés au bord du gyre subtropical de l'Atlantique Nord sur l'archipel des Açores (Portugal; point vert foncé; répartition indiquée en vert) et des fulmars boréaux ont été prélevés près de Qikiqtarjuaq, au Nunavut, dans l'Atlantique Nord-Ouest (point violet foncé; répartition indiquée en violet).

Les embranchements au sein de chaque échantillon (n = 169 échantillons obtenus à partir de 85 oiseaux de mer individuels) sont tracés en fonction de leur abondance relative sur l'axe des ordonnées. Les embranchements à faible abondance (prévalence < 0,1 et abondance < 10) sont regroupés et étiquetés comme "Autre".

Chaque point représente un échantillon de microbiome qui est coloré par l'emplacement dans le GIT, soit du microbiome proventriculaire (points bleus, n = 85) soit du microbiome cloacal (points orange, n = 84). Métrique de diversité alpha La métrique H d'Allen est tracée par rapport à a la proportion de comptages MP (comptage MP/masse individuelle des oiseaux) et b la proportion de masse MP (masse MP/masse individuelle des oiseaux). Les lignes de chaque graphique indiquent les valeurs prédites basées sur le modèle mixte linéaire pour la métrique de diversité alpha et les zones ombrées flanquant les lignes indiquent les intervalles de confiance supérieur et inférieur à 95 %.

Diagrammes d'ordination de l'analyse des coordonnées principales (PCoA) avec des distances UniFrac pondérées a, b, des distances UniFrac non pondérées c, d et des diagrammes d'ordination de l'analyse des composantes principales (PCA) e, f avec des distances euclidiennes (approche d'Aitchison). Chaque point représente un échantillon de microbiome coloré sur une échelle continue par (a,c,e) la proportion du nombre de MP (nombre de MP/masse d'oiseau individuelle ; n = 169) et (b,d,f) la proportion de masse de MP (masse de MP/masse d'oiseau individuelle ; n = 169) et les flèches magenta indiquent la direction des effets MP.

Les tracés PCoA avec les distances UniFrac pondérées a,b, les distances UniFrac non pondérées c,d et les tracés PCA e,f avec les distances euclidiennes (approche d'Aitchison) illustrent les effets des comptages MP sur les oiseaux marins proventriculaires (a,c,e; n = 85) par rapport à la diversité bêta microbienne cloacale (b,d,f; n = 84). Chaque point représente un échantillon de microbiome coloré sur une échelle continue par la proportion du nombre de MP (nombre de MP/masse individuelle des oiseaux) et les flèches magenta indiquent la direction des effets MP.

Les parcelles PCoA avec les distances UniFrac pondérées a, b, les distances UniFrac non pondérées c, d et les parcelles PCA e, f avec les distances euclidiennes (approche d'Aitchison) illustrent les effets du nombre de MP sur la diversité bêta microbienne GIT chez les fulmars boréaux ( a, c, e ; n = 27) par rapport aux puffins cendrés ( b, d, f ; n = 58). Chaque point représente un échantillon de microbiome coloré sur une échelle continue par la proportion du nombre de MP (nombre de MP/masse individuelle des oiseaux) et les flèches magenta indiquent la direction des effets MP.

Les tracés PCoA avec les distances UniFrac pondérées a,b, les distances UniFrac non pondérées c,d et les tracés PCA e,f avec les distances euclidiennes (approche d'Aitchison) illustrent les effets de la masse MP sur les oiseaux de mer proventriculaire (a,c,e; n = 85) par rapport à la diversité bêta microbienne cloacale (b,d,f; n = 84). Chaque point représente un échantillon de microbiome coloré sur une échelle continue par la proportion de masse MP (masse MP/masse individuelle des oiseaux) et les flèches magenta indiquent la direction des effets MP.

Les tracés PCoA avec les distances UniFrac pondérées a,b, les distances UniFrac non pondérées c,d et les tracés PCA e,f avec les distances euclidiennes (approche d'Aitchison) illustrent les effets de la masse MP sur la diversité bêta microbienne GIT chez les fulmars boréaux (a,c,e; n = 27) par rapport aux puffins cendrés (b,d,f; n = 58). Chaque point représente un échantillon de microbiome coloré sur une échelle continue par la proportion de masse MP (masse MP / masse d'oiseau individuelle) et les flèches magenta indiquent la direction des effets MP.

Résultats complémentaires.

Légendes pour chaque tableau inclus dans chaque feuille de calcul Excel.

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Réimpressions et autorisations

Fackelmann, G., Pham, CK, Rodríguez, Y. et al. Les niveaux actuels de pollution microplastique ont un impact sur les microbiomes intestinaux des oiseaux de mer sauvages. Nat Ecol Evol 7, 698–706 (2023). https://doi.org/10.1038/s41559-023-02013-z

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Reçu : 21 avril 2022

Accepté : 14 février 2023

Publié: 27 mars 2023

Date d'émission : Mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41559-023-02013-z

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